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分子靶向藥在兒童及青少年骨肉瘤臨床治療中的應用與前景1、前言隨著精準醫(yī)學的不斷發(fā)展，分子靶向藥的應用成為了目前的熱門話題。遺憾的是，骨肉瘤沒有類似于非小細胞肺癌那樣源基因驅動的點突變，而更加特此性地標為染色體碎裂、全基因組復制(WholeGenomeDoubling,WGD)導致的基因擴增和重排[1]。骨肉瘤具有復雜的基因不穩(wěn)定性和高度的遺傳異質性；同時可特征性地出現某些抑癌因子和癌基因的改變，包括p53、Rb、CDK4、MDM2和MYC[2]。雖然全外顯子測序做了大量的研究，但是其實分析大多數局限于已知基因的變化，但是測序中的已知基因只占骨肉瘤測序基因中的15%左右，多數沉沒于水中的基因還有很多待探索的空間[3]。同時，這些檢測到的基因結構變異是否為用藥的靶點有待進一步探索。由于單一藥物不太可能導致明顯的骨肉瘤退縮，因此臨床常需聯合用藥[1]。幾十年來，骨肉瘤的治療一直集中在細胞毒性藥物（化療藥）和細胞抑制性藥物（靶向藥）的開發(fā)，但常因存在腫瘤間或腫瘤內的異質性而導致令人失望的結果[1]。雖然免疫治療可以誘導腫瘤的持久反應和改善預后，但在近年來的免疫節(jié)點抑制劑的臨床試驗中僅有少數個案的骨肉瘤患者獲得了可持續(xù)的臨床受益，且在整體人群中無統(tǒng)計學生存優(yōu)勢[1,4,5]。如何選擇可能受益于免疫治療的骨肉瘤亞群已成為迫切需要解決的問題。2、兒童及青少年骨肉瘤基因型特點2.1骨肉瘤基因型的復雜性骨肉瘤，尤其是青少年的骨肉瘤，特征性地存在復雜的核型。早年，BridgeJA等[6]的研究提示，骨肉瘤的基因型充斥著異倍體、反復的染色體斷裂和重排。因此得出結論，骨肉瘤的基因型特征為染色體的異樣斷裂，且呈個體“指紋樣”的差異。這是第一篇形容骨肉瘤的染色體斷裂點并非隨機，更多地出現在1,2,3,4,11,12,14,16,17,19和22號染色體的特定區(qū)域。同時，雜合性缺失（lossofheterozygosity,LOH）在該疾病也極其重要，突出在17號染色體，腫瘤抑癌基因TP53的改變由此而來[7]。2023年的結締組織腫瘤（ConnectiveTissueOncologySociety,CTOS）年會上,由波士頓兒童醫(yī)院牽頭的全美12家兒童腫瘤建立的骨肉瘤基因測序數據庫GAIN（GenomicAssessmentInformsNovelTherapy）有報告了新的結果，人們把傳統(tǒng)的關注于脫氧核糖核酸（DNA）的測序轉向于核糖核酸（RNA）測序的結果，提出骨肉瘤大多數的結構變異（StructuralVariation,SVs）是染色體碎裂事件的一部分，并不能用已知的機制來解釋[8]。在同一腫瘤身上可以看到非常多的核型的多樣性。而缺失-染色體易位-擴增（Loss-Translocation-Amplification,LTA）的染色體碎裂導致了相伴的TP53缺失，癌基因的擴征和WGD[8]。LTA是一種新的重排機制，解釋了骨肉瘤復雜的基因型，且這種改變只出現于骨肉瘤，而在其他31種兒童癌癥中不曾出現。在為數不多的描述骨肉瘤基因型的文獻中（表1），高度提示以下抑癌和原癌基因的改變：CDK4/6，P53，MDM2，MYC，Rb等等[9,10]。馬丁等[11]提出骨肉瘤的主要染色體改變?yōu)?q,6q,9,10,13和17p染色體的節(jié)段缺失和3q,6q,9,10,13和17p染色體的倍增，而6p染色體的獲得通常涉及RUNX2,VEGFA,E2F3,PIM1和CCND3的改變，這些在骨肉瘤的成癌機制上均有研究。盡管如此，配對標本進行腫瘤進化過程的研究極少，關于骨肉瘤的成因，Negri及其同事通過深度測序13對骨肉瘤原發(fā)灶和轉移灶的標本，提出隨著系統(tǒng)治療的推移，骨肉瘤的拷貝數高度保守，提示該腫瘤基因型不穩(wěn)的概念可能需要更新[12]。而北大人民醫(yī)院姬濤教授曾通過個案分析，提出骨肉瘤的三種不同的進化模式，并同臨床治療過程相關聯，提示不同的進化模式的腫瘤學預后及對藥物的反應不同[13]。北大人民醫(yī)院湯小東教授曾使用15對骨肉瘤原發(fā)及轉移配對標本進行進化模式的分析，結果顯示非沉默突變的基因組圖譜、腫瘤突變負荷在原發(fā)灶和配對轉移灶之間無明顯差異。進一步采用系統(tǒng)發(fā)育樹與腫瘤系統(tǒng)發(fā)育分析顯示了亞克隆進化模型（基于突變和拷貝數）和基于體細胞單核苷酸變異等位基因頻率的多標本譜系樹。骨肉瘤初始骨轉移還是骨肉瘤初始肺轉移均類似于大進化模式，即莖分支基因與主干基因整體差異較大，主要表現為未知的基因改變，原因不明，染色體碎裂和碎片較多[14]。2.2骨肉瘤常見的信號通路變異通過對骨肉瘤標本的全基因組測序，MDAnderson率先進行了各類信號通路的歸類和分析，提出骨肉瘤的基因型不穩(wěn)定與各類信號通路是相關聯的，也是骨肉瘤基因型的路標[15]。1）TP53既往的外顯子測序研究曾提示20-50%骨肉瘤病例存在TP53的改變，而且往往存在于1號內含子的改變中[7,16]。然而，在陳等[17]的34名兒童骨肉瘤病人的全基因組測序中，55%的TP53基因型改變來源于結構變異。而36名來源于MDAnderson的骨肉瘤病人的標本中，僅有25%的病人存在TP53的結構變異[18]。TP53通路的缺失使細胞對DNA損傷基因型不穩(wěn)，進而導致了骨肉瘤的發(fā)生。許多TP53缺失的細胞系產生了骨肉瘤，同時上文提到LTA也導致了TP53的改變，相輔相成[8]。2）Rb1和其他DNA損傷修復的信號通路視網膜母細胞留轉錄公受體1（Retinoblastomatranscriptionalcorepressor1,RB1），是控制細胞周期G/S轉換過程中關鍵的調節(jié)因子，也是骨肉瘤基因型描述中較為常見的基因型改變。在不同的二代測序的基因型研究中，Rb1基因型的改變發(fā)生頻率為50-78%不等，其主要作用為防止因為DNA損傷而細胞周期停滯，促進腫瘤發(fā)生發(fā)展[6,7,9,14,19]。在小鼠模型中不像TP53，單純的Rb1改變不足以誘導骨肉瘤的產生，因而很多研究假設Rb1信號通路的改變協同了TP53的失活，進而導致了骨肉瘤的產生[20]。Behjati等[2]研究提示COSMIC基因印記5和8是骨肉瘤基因測序中最常見的印記，與預后差顯著相關，與該信號通路相關。3）端粒延長信號通路端?？梢员Ｗo細胞的染色體免于DNA損傷，在每次細胞分裂后染色質變得更短，最終導致細胞的衰老或凋亡。在骨肉瘤發(fā)生的過程中，經常出現端粒酶依賴的或不依賴的染色質延長機制，在細胞分裂持續(xù)進行，并使基因型不穩(wěn)的細胞進化克隆的過程中加速細胞周期依賴的分離，避免端粒的縮短[21]。端粒基因的啟動子突變，既往報道出現在4.3%的骨肉瘤標本中[22]。而非端粒酶依賴的機制，被稱為更改的端粒延長機制，往往和ATRX失活有關，在MDAnderson骨肉瘤隊列的檢測中，ATRX導致的改變的發(fā)生率約20%，與TP53也有一定的聯系[19,23]。目前有關于端粒酶的ATR抑制劑，以及其他關于DNA損傷修復反應相關的抑制劑的臨床試驗正在進行的過程中[1]。4）胰島素樣生長因子受體通路/PI3K-mTOR通路在MDAnderson的研究中20%的骨肉瘤樣本存在胰島素樣生成因子受體通路的激活[2,24]。另外，Perry等[18]發(fā)現，在胰島素樣生長因子的下游，PI3K或MAPK信號通路的激活也存在于27%的骨肉瘤標本中。進一步，該團隊通過細胞系實驗，驗證了抑制該細胞信號通路可以抑制骨肉瘤的進展，為重要的靶標。在MDAnderson的測序分析中，涉及該通路的骨肉瘤占78%。在生物學標記物有限的情況下，使用胰島素樣生長因子受體的單抗、mTOR及PI3K的抑制劑也可能是骨肉瘤協同治療的靶點[19]。2.3從基因的角度看骨肉瘤的免疫微環(huán)境轉錄組分析（Transcriptome）來源于對大體RNA數據的整理以及其他方案來研究骨肉瘤與其免疫微環(huán)境的相互作用，近年來成為熱門話題。但是，由于免疫檢查點抑制劑的臨床試驗，例如SARC028中免疫應答者相比于無免疫應答者的比例懸殊，無法進行轉錄組學分析和比對，以發(fā)現有意義的轉錄組差異[4]。為了更好地理解骨肉瘤的免疫浸潤浸潤水平，MDAnderson比較了其他腫瘤亞型的TCGA（theCancerGenomeAtlas,TCGA）、87名TARGET數據庫中骨肉瘤，以及一些零星的研究中的轉錄組學中免疫浸潤評分，結果發(fā)現骨肉瘤患者的轉錄組學免疫浸潤評分相比于其他腫瘤患者低得多；同時腫瘤浸潤淋巴細胞CD8+與PD-L1/PD-1的染色相關[19]。GAIN的系列研究也發(fā)現骨肉瘤單細胞測序提示骨肉瘤個體間存在巨大的異質性，骨母細胞型、軟骨母細胞型及纖維母細胞型等常見普通型骨肉瘤的免疫微環(huán)境中存在顯著的免疫熱度差異，以及表觀遺傳學調控的靶點[25]。2.4RECQ家族和基因不穩(wěn)Rothmund-Thomson綜合癥（RTS）是1868年被德國眼科醫(yī)生AugusteRothmund所描述，主要表現為皮膚一色癥。直到1999年，該綜合征才被發(fā)現RECQL4基因的突變[26]。目前所知，2/3的RTS存在RECQL4基因的突變（II型）而1/3的RTS存在ANAPC1基因的突變（I型）。既往的研究發(fā)現，病理性RECQL4突變與骨肉瘤致病相關，而RECQL4解旋酶主要起抑制骨肉瘤發(fā)生的作用[27]。因而RTS是研究骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的天然模型。但是來源于RTS的骨肉瘤和散發(fā)的骨肉瘤模型不同，這類骨肉瘤傾向于發(fā)生于少見的骨的部位，且呈多中心發(fā)生的傾向。RECQL4基因在DNA損傷修復中的作用，臨床醫(yī)生往往在給這類病人常規(guī)一線化療的過程中，需要因為粘膜炎癥而進行劑量減量。高通量測序提示這類骨肉瘤可能存在腫瘤微衛(wèi)星灶不穩(wěn)（microsatelliteinstability,MSI）[28]。RECQL4誘導的骨肉瘤模型的細胞可能過表達RAD51，提示該類腫瘤可能可以采用端粒酶抑制劑聯合免疫治療來進行系統(tǒng)治療[28]。2.5骨肉瘤的表觀遺傳學表觀遺傳學的管控解除為腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中重要的環(huán)節(jié)，主要表現為在染色體調控序列中通過組蛋白去乙酰化酶（histonedeacetylases,HDACs）的乙?；腿ヒ阴；?，以及DNA甲基轉移酶（DNAmethyltransferases,DNMTs）甲基化的修飾，進而導致下游通路轉錄表達是否正常進行，影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在骨肉瘤中，Rb1和p53基因通路是超甲基化的，在DNMTs抑制劑治療的過程中會過度表達[29]。因而骨肉瘤細胞系會被好幾種DNMTs抑制，而被影響成骨樣分化。溴結構域和外端基序蛋白抑制劑（thebromodomainandextra-terminalmotifproteins，BETi）可可逆地作用域溴結構域，導致一系列的蛋白表達的重排[30]。2023年CTOS年會中，Katherine團隊[25]從轉錄組學研究中區(qū)分普通型骨肉瘤3個亞型的差異，并進一步提出不同的表觀遺傳學靶點針對不同亞型的骨肉瘤有著不一樣的控制作用，TMP195/269（經典的IIa型HDAC）抑制劑等。3、目前多靶點靶向藥物的應用目前骨肉瘤的前瞻臨床試驗中，雖然沒有源基因驅動的靶向藥作為骨肉瘤治療靶點的結果，但是，另外一類廣譜的，抗血管生成（Anti-angiogeneticTyrosineKinaseInhibitors）的靶向藥物卻是明確可以延長進展期患者的疾病無進展生存期（見表2）[31-35]。但是，此后的臨床研究發(fā)現，這類藥物發(fā)揮作用主要依靠的是宏觀上抑制腫瘤新生血管和供氧，腫瘤細胞膜表面的靶點的表達，例如VEGFR-2（血管內皮生長因子受體-2，VascularEndothelialGrowthFactorReceptor-2）、VEGFR-3、FGFR（成纖維細胞生長因子受體,FibroblastGrowthFactorReceptor）、PDGFR-β（血小板衍生生長因子受體,Platelet-DerivedGrowthFactorReceptor）等沒有直接療效的關系。進一步的臨床試驗發(fā)現，卡博替尼（cabozantinib）的前瞻的單臂研究中明顯疾病無進展生存期長于其他類似的靶向藥物，主要源自于其除了常規(guī)抑制劑靶點外，還抑制了MET、RET等靶點[34]。因而此后，這類靶向藥物更多地被稱為多靶點酪氨酸激酶的抑制劑（Multi-TargetTyrosineKinaseInhibitors）更加確切。目前在兒童腫瘤協作組中，初治的骨肉瘤患者正在進行卡博替尼與一線化療方案MAP的聯用（詳見圖1），以期進一步改善初治骨肉瘤的療效和長期預后。這類靶向藥最大的問題是繼發(fā)耐藥，往往窗口期為4-6月，對瘤體負荷大、高度惡性（G3）且存在肺外轉移病灶的患者，如何克服繼發(fā)耐藥是亟待解決的問題[5,31-34]?；A研究顯示這類多靶點抑制劑在強烈收縮供瘤血管，導致腫瘤乏氧而抑制腫瘤生長的同時，很容易破壞供瘤血管的血管內皮，進而導致微觀上更多的腫瘤細胞進入循環(huán)系統(tǒng)，而進入循環(huán)系統(tǒng)中的腫瘤細胞更容易定值在這類多靶點靶向藥血藥濃度不高的部位，例如：腦、肝、骨、軟組織等[36]?；谶@樣的前提，目前臨床上使用這類靶向藥聯合化療藥物（化療藥物減量，小劑量的節(jié)拍化療）可有效避免循環(huán)血液中腫瘤細胞定植于肺外病灶的情況。因此，聯合用藥的疾病無進展生存期較單純靶向治療可顯著延長（表3）。但是，如何克服藥物聯用引發(fā)的更多毒副作用成為另一個亟待解決的問題。2022年末，郭衛(wèi)教授召集全國專家進行了聯合用藥的毒副作用專家共識編寫，對常見的聯合用藥問題進行了探討和總結，也許可以解決一些臨床上常見的問題[37]。4、在研的源基因驅動的靶點PaulS.Meltzer等[1]在2021年的新英格蘭雜志發(fā)表了一篇關于骨肉瘤的綜述，其中提到根據目前精準醫(yī)學的理念，在骨肉瘤精準醫(yī)學對應的可操作的靶點包括以下：1）基因拷貝數的畸變；2）基因的表達；3）DNA甲基化；4）腫瘤突變負荷；5）胚系DNA序列的遺傳風險；6）多樣化影像顯影（例如多色免疫熒光染色之類的）。目前更多的源基因驅動的靶向藥治療著眼于骨肉瘤的DNA損傷修復及同源重組缺陷（HomologousRecombinationDeficient,HRD），例如波士頓兒童醫(yī)院牽頭的PARP抑制劑聯合ATR抑制劑作用于轉移性或難治性骨肉瘤的臨床試驗。同時，MYC原癌基因的擴增，也與預后顯著相關，曾經嘗試進行表觀遺傳學AuroraA酶的抑制劑進行調控，但是臨床試驗結果不太理想，沒有進一步探索[38]?？贵w偶聯的藥物（AntibodyDrugConjugates,ADC）是一種新型的靶點藥物，主要是根據多樣化影像顯影來檢測，是一種新的治療方向。目前在研的靶點有細胞表面蛋白LRRC15，IB期隊列研究發(fā)現骨肉瘤及骨的多形性未分化肉瘤的客觀緩解率均達20%，療效持續(xù)的時間還需要進一步隨訪[39]。MDAnderson在研的ADC靶點MT1-MMP（BT1769）[40]。北京大學人民醫(yī)院郭衛(wèi)教授牽頭的全國多中心臨床試驗HS-20093（針對B7-H3靶點）均有初步不錯的臨床療效，進一步的生存學數據期待更長時間的隨訪。GAIN研究團隊在對青少年普通型骨肉瘤進一步分型分析后，發(fā)現部分治療靶點可能對特定的人群有一定的幫助，適合于單藥或聯合治療，例如：Bardoxolone（REL/NFκB抑制劑）、Tegavivint（β-catenin/TBL1抑制劑）、Dinaciclib（CDK2/5/9抑制劑）、AZD1390（ATM/ATR抑制劑）、Valemetostat(EZH2/EZH1抑制劑)等[25]。5、靶向藥應用前景的思與辯由于缺乏對骨肉瘤免疫微環(huán)境更多免疫靶點的認知，骨肉瘤遺傳基因型的復雜性，病例數及樣本量的缺陷等等，限制了對骨肉瘤新的治療方式的開發(fā)，目前對骨肉瘤的精準治療尚處于起步的階段[11,19]。一些多靶點、廣譜的，以抗血管生成為主的治療，雖然短期內可以抑制腫瘤的生長，但是并不改善患者的總生存期。而源基因驅動的靶向藥的開發(fā)，在骨肉瘤并不像非小細胞肺癌那樣成功，我們暫時無法發(fā)現“解藥”來從本質上抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。但在現有的條件下，一些臨床客觀的認知，可以幫助我們更好地延長患者的生存期和改善生活質量。例如，在靶向治療的過程中，巨大的瘤體負荷，大劑量的藥物劑量，最容易引發(fā)繼發(fā)耐藥，那么適當通過局部治療（手術或者放療或者海扶刀）來減少瘤體負荷，以期使用“小劑量的靶向藥來做最長時間的維持”，而避免病人生活質量因為藥物治療而受到影響，使得瘤體負荷最小，突出“維持治療”的治療效果。另外，針對瘤體負荷過大，存在肺內病灶及肺外病灶的進展期患者，靶向聯合化療無法時，化療藥物采用常規(guī)劑量的3/5，以期用“節(jié)拍化療”的方式，避免過大的毒副作用和嚴重的骨髓抑制的發(fā)生，同時也起到了預防肺外病灶進展的可能[41]?？贵w偶聯藥物的出現，讓持久呈現為疾病穩(wěn)定的骨肉瘤有了更多客觀緩解，但是隨之出現的繼發(fā)耐藥也是亟待解決的問題。如何有效地規(guī)避耐藥，如何更好地進行藥物聯用，還有很多值得探索的地方。畢竟對不可切除的實體瘤來說，靶向藥和化療無法帶來可持續(xù)的療效，更好的排兵布陣，也許能讓患者有更多生存學的受益。6、參考文獻1.PaulSMeltzer,L.J.H.,NewHorizonsintheTreatmentofOsteosarcoma.NEnglJMed.,2021.385(22):p.2066-2076.2.SamBehjati,P.S.T.,KerstinHaase,HongtaoYe,MatthewDYoung,LudmilBAlexandrov,SarahJFarndon,GraceCollord,DavidCWedge,InigoMartincorena,SusannaLCooke,HelenDavies,WilliamMifsud,MathiasLidgren,SanchaMartin,CalliLatimer,MarkMaddison,AdamPButler,JonWTeague,NischalanPillay,AdamShlien,UltanMcDermott,PAndrewFutreal,DanielBaumhoer,OlgaZaikova,BodilBjerkehagen,OlaMyklebost,MFernandaAmary,RobertoTirabosco,PeterVanLoo,MichaelRStratton,AdrienneMFlanagan,PeterJCampbell,RecurrentmutationofIGFsignallinggenesanddistinctpatternsofgenomicrearrangementinosteosarcoma.NatCommun.,2017.8:p.15936.3.LuXie,Z.C.,HezheLu,FanfeiMeng,XinZhang,KunLuo,XiaoxingSu,YanLei,JiuhuiXu,JingbingLou,HanWang,ZhiyeDu,YunfanWang,YuanLi,TingtingRen,JieXu,XinSun,XiaodongTang,WeiGuo,Distinctgenomicfeaturesbetweenosteosarcomasfirstlymetastasingto4.HusseinATawbi,M.B.,VanessaBolejack,BrianAVanTine,ScottMSchuetze,JamesHu,SandraD‘Angelo,StevenAttia,RichardFRiedel,DennisAPriebat,SujanaMovva,LaraEDavis,ScottHOkuno,DamonRReed,JohnCrowley,LisaHButterfield,RuthSalazar,JaimeRodriguez-Canales,AlexanderJLazar,IgnacioIWistuba,LaurenceHBaker,RobertGMaki,DeniseReinke,ShreyaskumarPatel,Pembrolizumabinadvancedsoft-tissuesarcomaandbonesarcoma(SARC028):amulticentre,two-cohort,single-arm,open-label,phase2trial.LancetOncol.,2017.18(11):p.1493-1501.5.LuXie,J.X.,XinSun,WeiGuo,JinGu,KuishengLiu,BingxinZheng,TingtingRen,YiHuang,XiaodongTang,TaiqiangYan,RongliYang,KunkunSun,DanhuaShen,YuanLi,Apatinibpluscamrelizumab(anti-PD1therapy,SHR-1210)foradvancedosteosarcoma(APFAO)progressingafterchemotherapy:asingle-arm,open-label,phase2trial.JournalforImmunoTherapyofCancer,2020.8(1):p.e000798.6.al,B.J.e.,Cytogeneticfindingsin73osteosarcomaspecimensandareviewoftheliterature.CancerGenetCytogenet,1997.95(1):p.74–87.7.al,K.M.e.,ExomesequencingofosteosarcomarevealsmutationsignaturesreminiscentofBRCAdeficiency.NatCommun.,2015.6:p.1-9.8.al.,I.C.-C.e.,Mechanismsandevolutionarytrajectoriesofcomplexgenomerearrangementsinosteosarcoma.CTOSannualmeetingoralpresentation,2023.4(1):p.1-9.9.al,S.Y.e.,Clinicalgenomicsequencingofpediatricandadultosteosarcomarevealsdistinctmolecularsubsetswithpotentiallytargetablealterations.ClinCancerRes,2019.25(21):p.6346–6356.10.al,S.L.e.,Genome-informedtargetedtherapyforosteosarcoma.CancerDiscov,2019.9(1):p.46–63.11.MartinJW,S.J.,ZielenskaM,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